作者：宋洋 北京積水潭醫院

關于巨噬細胞基因表達的研究歷來集中于導致RNA聚合酶II募集和轉錄啟動的事件，而啟動后步驟對巨噬細胞激活的貢獻仍知之甚少。在這里，我們報道了廣泛的啟動子近端RNA聚合酶II在靜息巨噬細胞中暫停的標志是負延伸因子（NELF）復合物的共定位，并由PU促進。在炎癥刺激時，超過60%的活化轉錄組受聚合酶暫停釋放和染色質的瞬時全基因組NELF解離的調節，出乎意料地，獨立于CDK9（一種推測的NELF激酶）。巨噬細胞中NELF的遺傳破壞增強了編碼Fos和Jun的AP-1的轉錄，從而增強了包括Il10在內的AP-1靶點的轉錄。IL-10（一種關鍵的抗炎細胞因子）的表達增加，反過來減少了促炎介質的產生，最終減少了體內巨噬細胞介導的炎癥。總之，這些發現確立了NELF在抑制炎癥抑制劑的轉錄從而使炎癥巨噬細胞活化方面先前未被認識到的作用。
炎癥已演變為對環境線索的快速反應，并導致一系列生理和病理過程，包括宿主防御、組織損傷和代謝變化。炎癥的潛在有害影響需要存在精確的調節機制來控制其大小和持續時間。事實上，巨噬細胞的激活是炎癥反應的一個重要組成部分，在多個層面受到嚴格的控制。例如，在激活過程中，巨噬細胞轉錄組經歷了大量的重編程，數百個基因快速上調和下調了數百甚至數千個折疊，將轉錄作為這些細胞中調控電路的關鍵節點。巨噬細胞激活通常由細胞表面或內體受體的連接觸發，其啟動細胞內信號傳導，最終導致序列特異性轉錄因子和RNA聚合酶（Pol）II募集到靶基因loci。歷史上，Pol II募集和轉錄起始被認為是基因激活的主要限速步驟。然而，這一觀點后來受到了幾項研究的挑戰，這些研究報告稱，在靜息巨噬細胞中，許多炎性基因（如Tnf）的轉錄起始位點（TSS）被Pol II9,10預加載，這提高了其激活的限速步驟發生在轉錄起始后的可能性。
事實上，最近主要在果蠅和干細胞中進行的許多研究都描述了Poll II啟動子——近端暫停、暫停釋放和進入生產性伸長同樣容易受到調。具體而言，在形成預引發復合物（PIC）后，Pol II啟動轉錄，合成短（20-60?nt）新生RNA，然后暫停。進一步的生產性伸長需要信號依賴性暫停釋放，以將Pol II動員到基因體區域。鑒于Pol II暫停的重要性，暫停的建立及其釋放受到過多的積極和消極因素的高度調節，包括負延伸因子（NELF）、DRB敏感性誘導因子（DSIF）和正轉錄延伸因子-b（P-TEFb）。在源自生化研究的經典暫停釋放模型中，四亞基NELF復合物結合并將Pol II保留在啟動子近端區域。暫停釋放被認為是由細胞周期蛋白依賴性激酶9（CDK9）和細胞周期蛋白T1組成的異二聚體P-TEFb復合物對NELF的信號誘導磷酸化所觸發的，這導致NELF從啟動子中消失。此外，P-TEFb磷酸化DSIF，將其從暫停轉化為延長促進因子，并在Pol II C末端結構域（也被CDK12靶向）中的七肽重復序列中的絲氨酸2殘基，這被認為共同促進Pol II進入基因體并產生轉錄延長。
轉錄的啟動后調控涉及關鍵的生物學過程，包括胚胎發生和發育。啟動后機制對免疫細胞功能的貢獻尚未得到廣泛認可，盡管一些開創性研究已經提供了強有力的證據，證明存在這種類型的調節，特別是在對環境線索快速反應的細胞如巨噬細胞中。TLR4的連接，然后是NF?kB募集，導致P-TEFb與許多基因位點結合。事實上，我們和其他人的研究表明，P-TEFb負載和轉錄延長是如何被炎癥的負調節因子（包括糖皮質激素受體和其他轉錄抑制因子）靶向的，這突出了早期延長期間免疫基因調節的生理重要性。盡管如此，這些研究主要集中于感興趣基因的特定亞群，而轉錄對巨噬細胞激活的啟動后控制的特征和全球影響仍有待深入研究。
在這里，通過采用基因組、藥理學和生物化學方法，我們全面繪制了巨噬細胞激活過程中啟動后轉錄景觀。我們描述了巨噬細胞炎癥激活過程中“暫停因子”NELF與染色質的驚人的全局和動態相互作用，以及譜系決定轉錄因子PU.1對這一過程的意外貢獻。利用巨噬細胞中Nelfb的基因破壞，我們鑒定了一組功能和轉錄多樣的NELF調節基因，這些基因對炎癥信號做出異常反應，并定義了一種將NELF直接轉錄控制下的暫停基因與其免疫系統中下游效應器連接起來的途徑。最后，我們描述了體內巨噬細胞特異性NELF耗竭的后果，從而確立了NELF在哺乳動物炎癥反應中的生理作用。
為了全面定義與小鼠原代骨髓源性巨噬細胞（BMDM）中信號誘導轉錄相關的全局Pol II暫停模式，我們進行了Pol II染色質免疫沉淀，隨后進行了高通量測序（染色質免疫共沉淀（ChIP）-seq）和精確核運行測序（PRO seq）。在10076個由RNA-seq（下文稱為“BMDM轉錄組”）定義的BMDM中表達的獨特基因中，絕大多數基因顯示了啟動子-近端暫停的特征，如根據TSS區域與基因體區域中的Pol II ChIP-seq信號計算的高暫停指數（PI）所定義的。高度暫停（PI?≥?3，第1組）和適度暫停（1.5?≤?圓周率?